原创 王娟博士团队 自闭症医学进展 2024-03-16 13:38 北京
简介：南方医科大学附属珠江医院的王前、周宏伟团队发现，肠道先天发育不良和高氧化应激是影响孤独症生命早期肠道菌群定植并驱使孤独症行为发生发展的重要因素。本项研究于2022年6月发表在《大脑、行为和免疫》（Brain, Behavior and Immunity）上。
一、背景介绍
肠道菌群在孤独症的发生发展中发挥着重要作用。前期研究表明，孤独症儿童的肠道菌群较健康儿童呈现渐进式偏离，肠道中常见正常菌群定植困难[1]。2022年6月，南方医科大学附属珠江医院的王前、周宏伟团队发现[2]，肠道先天发育不良和肠道氧化应激水平升高是影响孤独症生命早期肠道菌群定植和驱使孤独症行为发生发展的重要因素，通过补充超氧化物歧化酶减轻肠道氧化应激有望缓解孤独症症状。
二、研究方法
本项研究的实验对象为健康小鼠和丙戊酸孤独症模型小鼠（以下简称VPA孤独症小鼠），取出生第0、7、21天的小鼠的肠道组织和粪便样本分别进行肠道发育指标、氧化应激指标和肠道菌群16S rRNA分析，并探究补充超氧化物歧化酶对小鼠肠道及行为的影响。本项研究还对比了14名2-7岁的孤独症儿童和13名同年龄段健康儿童的肠道菌群。
三、研究结果
1）VPA孤独症小鼠肠道先天发育不良
研究人员对比了VPA孤独症小鼠与健康小鼠的肠道形态与蛋白表达水平。发现在出生后0天、7天和21天时，VPA孤独症小鼠肠绒毛长度变短、密度降低，肠道中细胞增殖标记物Ki67、PCNA以及粘液产生标记物MUC2表达降低，同时肠道中多种连接蛋白（ZO-1、OCLN和CLND4）的表达也明显降低。
以上结果表明，VPA孤独症小鼠的肠道先天发育不良，表现为细胞增殖能力降低、粘液产生减少、肠屏障完整性受损，呈现肠道发育迟缓的形态学改变，并且在出生后的早期阶段仍然保持这种肠道发育不良的状态。
2）VPA孤独症小鼠在生命早期肠道持续呈现高水平的氧化应激和炎症
研究人员取出生第0、7、21天的小鼠的肠道组织，分别开展RNA测序和基因集富集分析（GSEA）、氧化应激和抗氧化应激因子水平测定以及炎症因子水平测定，以研究孤独症小鼠肠道的相关功能特征。氧化应激是指体内反应性氧自由基（活性氧）的产生与抗氧化防御机制之间失衡的状态，目前已发现氧化应激是孤独症的核心患病机制。
GSEA结果显示，与健康小鼠相比，VPA孤独症小鼠出生第0天时肠道中与谷胱甘肽代谢和谷胱甘肽转移酶活性相关基因的表达即出现显著下调，提示VPA孤独症小鼠的肠道先天抗氧化应激能力下降。
酶联免疫吸附实验（ELISA）结果显示，VPA孤独症小鼠在出生第21天时，肠道中的抗氧化应激因子，包括过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）和总抗氧化能力（TAOC）的水平均显著低于健康小鼠；同时，肠道中氧化应激相关指标如丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的水平显著升高。表明VPA孤独症小鼠在生命早期肠道中氧化应激水平增加。
炎症因子分析表明，相比健康小鼠，VPA孤独症小鼠在出生时和生命早期阶段（出生后的第0、7和21天）肠道中促炎细胞因子白细胞介素1β（IL-1β）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平呈现显著上调，表明VPA孤独症小鼠的肠道在小鼠出生时和生命早期持续呈现高炎症的状态。
这些结果表明，VPA孤独症小鼠的肠道呈现先天性的抗氧化应激能力低下，并且VPA孤独症小鼠在生命早期阶段肠道持续遭受高水平的氧化应激和炎症，这可能是导致VPA孤独症小鼠肠道发育不良的重要因素。
另外，KEGG通路分析还显示VPA孤独症小鼠的肠道功能变化与阿尔茨海默症和渐冻症等神经退行性疾病有一定相关性，提示在VPA孤独症小鼠生命早期阶段观察到的肠道特征可能具有超出肠道本身的意义。
3）VPA孤独症小鼠肠道先天发育不良塑造了失衡的肠道菌群
研究人员对比了VPA孤独症小鼠和健康小鼠在出生后的肠道菌群组成，发现二者在出生第0天时肠道菌群组成没有明显差异，而在出生后第7天和第21天观察到VPA孤独症小鼠的肠道菌群相较健康小鼠的肠道菌群呈现显著的分离态势，提示VPA孤独症小鼠的肠道菌群逐步偏离正常发育轨道。
具体而言，VPA孤独症小鼠肠道中肠球菌、链球菌等多种兼性厌氧菌以及拟杆菌、肽球菌、共生杆菌的丰度升高，而双歧杆菌、粪球菌、乳酸菌等专性厌氧菌的丰度降低。
联合肠道发育不良及氧化应激相关指标进行分析，发现在VPA孤独症小鼠肠道中，乳酸菌的丰度与肠道细胞的增殖和粘液产生能力以及肠道中抗氧化物谷胱甘肽的水平呈正相关，而与肠道中氧化应激因子丙二醛和过氧化氢的水平呈负相关；而萨特菌和瘤胃球菌的丰度与肠道细胞增殖、粘液产生能力以及肠道中抗氧化酶和总抗氧化能力呈负相关，与肠道氧化应激水平呈正相关。
此外，研究人员对比了2-7岁孤独症儿童和健康儿童的肠道菌群，发现了孤独症儿童同VPA孤独症小鼠的肠道菌群存在类似的改变，即肠道菌群较健康儿童组成存在明显差异，同时肠道中乳酸菌的丰度显著降低，而萨特氏菌和瘤胃球菌的丰度显著升高，提示这可能是孤独症的特征性肠道菌群变化。
上述结果提示，肠道菌群的形成与生命早期肠道的健康发育息息相关，孤独症肠道菌群失衡可能起源于先天肠道发育不良及肠道中高水平的氧化应激和炎症，即先天发育不良的肠道塑造了失衡的肠道菌群。
4）补充超氧化物歧化酶可改善肠道发育、减轻肠道氧化应激、修复肠道菌群失衡并缓解孤独症症状
超氧化物歧化酶（SOD）是一种在机体抗氧化防御机制中起到关键作用的酶，可通过将活性氧转化为氧分子从而减轻氧化应激。鉴于孤独症小鼠的肠道先天发育不良并且氧化应激水平高，研究人员继而通过给予VPA孤独症小鼠口服SOD的方式来探究减轻肠道氧化应激是否可以改善小鼠的肠道发育以及孤独症行为。
研究将VPA孤独症小鼠分为两组，一组是在小鼠断奶前（出生第2天至第21天）补充SOD，另一组在小鼠幼年期（出生第21天至第49天）补充SOD。
结果表明，不论是在断奶前还是在幼年期给VPA孤独症小鼠补充SOD，都可以降低肠道中的活性氧水平以及多项氧化应激指标和炎症因子的水平，显著提高肠道中多种紧密连接蛋白的表达，肠道粘液产生和细胞增殖能力明显恢复；同时肠道中乳酸菌的丰度升高至健康小鼠水平，萨特氏菌的丰度也降低至健康小鼠水平。
与此同时，行为学测试发现，补充了SOD的VPA孤独症小鼠社交障碍、重复刻板行为和焦虑样行为明显减少，与陌生小鼠的互动和对外界环境的探索增多，表明小鼠的孤独症症状得到明显改善。
以上结果提示，口服SOD可通过降低肠道中的氧化应激和炎症水平改善VPA孤独症小鼠的先天肠道发育不良、修复其肠屏障损伤，使得肠道中孤独症相关细菌的丰度恢复至健康水平，并改善小鼠的孤独症症状。
四、小结
VPA孤独症小鼠的肠道先天发育不良并伴随高水平的氧化应激和炎症，影响了生命早期肠道菌群的定植，使得乳酸菌丰度减少、萨特氏菌和瘤胃球菌丰度升高，并且在孤独症儿童的肠道菌群中也观察到相同的变化。
口服超氧化物歧化酶（SOD）可减轻VPA小鼠肠道氧化应激，改善肠道发育和肠屏障功能，使得孤独症相关肠道菌群得以修复，继而缓解小鼠的孤独症行为。
本项研究提出了孤独症儿童早期肠道菌群发育失衡的可能成因：即肠道先天发育不良通过氧化应激塑造了孤独症特征性肠道菌群，并参与孤独症行为的发生发展。补充SOD具有减轻肠道氧化应激的作用和缓解孤独症行为的潜力，有望作为孤独症辅助药物。
参考文献：
[1] Li J, Zhou H, Wang Q, et al. Congenitally underdeveloped intestine drives autism-related gut microbiota and behavior. Brain, Behavior and Immunity, 2022, 105: 15-26.